Bakteriologia gruźlicy - ...

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Dr hab. n. med. Sylwia Kwiatkowska
Klinika GruĨlicy i Chorób Páuc
Klasyfikacja prątków
Klasa -
Schizomycetes
Bakteriologia
gru
Rząd -
Actiomycetales
gruĨ
licy
licy
Rodzina -
Mycobacteriacae
Rodzaj -
Mycobacterium
àódĨ 2003
Mycobacterium tubeculosis complex
Podziaá prątków atypowych
wg Runyona
M. tuberculosis
Grupa prątków atypowych
Przedstawiciele
M. bovis
I
Prątki fotochromogenne
M. kansasii
M. microti
II
Prątki skotochromogenne
M. aquae
M. scrophulaceum
M. marinum
M. gordonae
M. africanum
M. avium
M. intracellulare
III
Prątki niefotochromogenne
M. canettii
M. fortuitum
M. phlei
M. smegmatis
M. vaccae
IV
Prątki szybko rosnące
atenuowana forma
M. bovis
BCG
Materiaáy, w których poszukujemy prątków
u chorych na gruĨlicĊSáuc
Metody wykrywania prątków
1.
Bakterioskopia
Plwocina spontaniczna
Plwocina indukowana
Popáuczyny ĪRáądkowe
Popáuczyny krtaniowe
Met. Ziehl-Neelsena
Specimeny bronchoskopowe
Met. fluorescencyjna
- auramina
- rodamina
- oranĪ akrydyny
Wynik
+ - pojedyncze prątki w preparacie
++ - pojedyncze prątki w poszczególnych polach widzenia
+++ - liczne prątki w poszczególnych p.w.
Bronchoaspirat
materiaá z cewnikowania
materiaá ze szczoteczkowania
BALF
1
Bakteriologia
Bakterioskopia
2.
Metoda hodowli
Met. Bakterioskopii – szybka, tania,
o niskiej czuáRĞci i swoistoĞci
=áoty standard w diagnostyce bakteriologicznej gruĨlicy
Nie odróĪnia prątków gruĨlicy od prątków
atypowych, w tym saprofitycznych
CzuáRĞü 80-85% - wykrywa 10 prątków w 1 ml badanego materiaáu
SwoistoĞü 98-100%
Uzyskany tą metodą wzrost prątków umoĪliwia ich dokáadną identyfikacjĊ
Wyhodowanie prątków umoĪliwia przeprowadzenie testów lekowraĪliwoĞci
Uzyskanie hodowli prątków umoĪliwia za pomocą metod genetycznych
przeĞledzenie áDĔcucha epidemiologicznego
Metoda hodowli
Metoda hodowli
NajczĊĞciej uĪywane podáRĪe
to podáRĪe Lowensteina-Jensena
Prątki widoczne nierosnące –
bacillus visibles non viables
Prątki rosną wolno 3-8 tygodni
6ą widoczne w badaniu mikroskopowym,
ale nie rosną na odpowiednich podáRĪach
Ocena nasilenia prątkowania
(+) - do 20 kolonii, wynik podawany jest liczbą
+ - liczba kol. 20-100
++ - 100-200, wzrost policzalny
+++ - powyĪej 200 kol., wzrost zlewny, niepoliczalny
Ich obecnoĞüáączy siĊ ze skuteczną terapią
Liczba ich wzrosáa po wprowadzeniu rifampicyny
Hodowla prątków w systemie Bactec 460
Metoda Bactec 460
Metoda jest szczególnie uĪyteczna w wykrywaniu
prątków w materiaáach skąpoprątkowych:
• páyn opáucnowy
• páyn mózgowo-rdzeniowy
• plwocina od chorych ze zmianami
minimalnymi w páucach
Wzrost prątków wystĊpuje pod koniec
pierwszego tygodnia, test lekowraĪliwoĞci
trwa nastĊpny tydzieĔ (dotyczy leków
pierwszej linii terapii)
2
Metoda MB/BacT
Odsetek dodatnich wyników
w róĪnych metodach hodowli
Prątki rosną na podáRĪu Middlebrooka 7H9,
a wytwarzany dwutlenek wĊgla powoduje zmianĊ
zabarwienia sensora umieszczonego w dnie butelki
z zielonej na ĪyáWą
MB/BacT
Bactec 460
L-J
Sygnaá detekcyjny w sposób ciąJáy
przekazywany jest do komputera,
który rejestruje intensywnoĞü wzrostu prątków
Mycobacterium
tuberculosis
complex
84,5
91,2
70,9
Metody serologiczne
Metody genetyczne
OdpowiedĨ humoralna w gruĨlicy nie ma charakteru
ochronnego.
OdpowiedĨ humoralna roĞnie wraz ze wzrostem
zaawansowania zmian.
Badania serologiczne istotne w gruĨlicy wieku
dzieciĊcego oraz pozapáucnej.
Stosowana jest metoda ELISA oceniająca obecnoĞü
przeciwciaá w stosunku do antygenu 38kDa i A60.
CzuáRĞü tej metody 30-70% (w páynie opáucnowym
50%)
1. Sonda genetyczna
Oparta jest na zjawisku hybrydyzacji pojedynczej
nici kwasów nukleinowych
z komplementarnym áDĔcuchem polinukleotydowym.
Sondy mogą byü róĪnej dáugoĞci, znakowane
Vą izotopami i wykrywane przy pomocy licznika
scyntylacyjnego, lub fosfatazą alkaliczną
i wykrywany w reakcjach barwnych,
lub za pomocą fluorescencji (oranĪ akrydyny).
Metody genetyczne
Metody genetyczne
2. Reakcja áDĔcuchowa polimerazy (PCR)
Etapy reakcji áDĔcuchowej polimerazy (PCR)
PCR polega na wielokrotnej amplifikacji wybranych
odcinków genomu prątka
denaturacja w temp 95
o
C 1-3 min z uzyskaniem
pojedynczej nici DNA
Warunkiem jej przeprowadzenia jest znajomoĞü
sekwencji nukleotydowej otaczającej powielany
fragment tak, aby moĪna uzyskaü jego
komplementarny odcinek – tzw. „starter” (primer).
doáączenie w temp 50-72
o
C starterów (0,5 – 3 min)
synteza DNA przy pomocy termostabilnej polimerazy
Taq w temp 72
o
C (0,5 – 3 min)
NajczĊĞciej powielanym fragmentem genomu prątka
jest sekwencja insercyjna IS 6110,
a w nastĊpnej kolejnoĞci IS 986,
gen kodujący HSP 65 kDa
Liczba cykli 30-40.
Zamplifikowany produkt wykrywa siĊ przy pomocy
znakowanych sond.
3
Przebieg reakcji áDĔcuchowej polimerazy
Metody genetyczne
3. Reakcja áDĔcuchowa ligazy
RównieĪ swoista dla
M. tuberculosis complex
.
Amplifikuje siĊ sekwencją kwasu nukleinowego
kodująFą antygen b (PAB).
Dwie pary oligonukleotydowych znakowannych
sond hybrydyzują z komplementarną nicią DNA.
Termostabilna polimeraza wypeánia brakujący
odcinek pojedynczej nici DNA.
Metody genetyczne
Reakcja áDĔcuchowa ligazy
Ligaza kowalencyjnie áączy dwie sąsiadujące sondy.
Zamplifikowany produkt absorbowany jest na
mikrocząsteczkach.
Detekcja odbywa siĊ w oparciu o reakcjĊ
fluorescencji w specjalnym analizatorze.
Metody genetyczne
Metody genetyczne
Reakcja áDĔcuchowa polimerazy i ligazy
4. Polimorfizm dáugoĞci
fragmentów restrykcyjnych (RFLP)
Wykrywa prątki
M. tuberculosis complex
Īywe
i martwe.
ĝrednia czuáRĞü 70-100%.
W materiaáach skąpoprątkowych waha siĊ pomiĊdzy
46 a 70%.
Dolna granica wykrywalnoĞci 10 prątków
w badanym materiale.
Identyfikuje poszczególne szczepy prątków,
wykorzystywana zwáaszcza w badaniach
epidemiologicznych.
Ocenia ona iloĞü oraz umiejscowienie w genomie
prątka sekwencji insercyjnej IS 6110 (1355 par
zasad).
4
Metody genetyczne
Metody genetyczne
Etapy RFLP
• ekstrahowanie DNA z komórek prątków
• poddanie go dziaáaniu enzymów
restrykcyjnych
• rozdzielenie fragmentów restrykcyjnych
na Īelu agarozowym
• przeniesienie rozdzielonego materiaáu
na nylonowe membrany
• hybrydyzacja ze znakowanymi sondami
komplementarnymi do 245 par zasad
fragmentu IS 6110
• odczyt komputerowy – ukáad i iloĞü linii
• odpowiada wielkoĞci poszczególnych
fragmentów.
Warunkiem zastosowania w badaniach
epidemiologicznych okreĞlonego markera
genetycznego (np. IS 6110) jest - z jednej strony -
jego zmiennoĞü, wystĊpująca wystarczająco szybko,
aby szczepy niezwiązane áDĔcuchem
epidemiologicznym byáy róĪne. Natomiast - z drugiej
strony – powinien on byü na tyle staáy, aby szczepy
poáączone ze sobą byáy identyczne. Okres
póátrwania dla IS 6110 wynosi 3-4 lata i wydaje siĊ
speániaü te wymogi.
Wynik metody RFLP
Am. J. Respir. Crit. Care
Med.. 1994 r.
Gran Canaria
1991-1996 rok
960 chorych
Wsk. zap. 30
18 chorych 2
×
zachorowaáo
w okresie co najmniej 12 m-cy
56%
Reactivatio endogenes
nie zakoĔczyli leczenia
opornoĞc na leki
44%
Reinfectio egzogenes
zakoĔczyli prawidáowo
leczenie
Metody chromatogaficzne
lekoopornoĞü
Chromatografia páynna wysokociĞnieniowa
HPLC (
High Preassure Liquid Chromatography
)
pierwotna
wtórna
New York
N Engl. J. Med. 1999 r.
Liczba i rodzaj kwasów mykolowych są
charakterystyczne dla kaĪdego gatunku.
Rozdziaá wyekstrahowanych kwasów mykolowych
na specjalnych kolumnach
a uzyskane wzory elucyjne są swoiste dla danego
gatunku prątka
1987-1991 rok
17 chorych HIV+ prątkujących w posiewie co najmniej 1 rok
I grupa
(ten sam szczep)
zachowana
wraĪliwoĞü
na leki
p. prątkowe
(ten sam
szczep)
lekoopornoĞü
pierwotna
i wtórna
4 chorych
I-szy szczep – zachowana
wraĪliwoĞü na leki
II nowy szczep
wielolekooporny
(lekoopornoĞü
pierwotna wtórnie nabyta)
5
[ Pobierz całość w formacie PDF ]